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https://www.nature.com/articles/s41467-023-44169-z

為了探究組合重復寡肽結構域的功能，研究團隊首先在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中表達了全長和組合重復寡肽缺失的TcsL蛋白。期間團隊成員發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象：組合重復寡肽缺失的TcsL在蛋白純化過程中會自發(fā)進行切割。通過質譜分析和突變實驗證實切割位點位于543位的亮氨酸和544位的甘氨酸，這是TcsL中的半胱氨酸蛋白酶的自剪切位點。在全長蛋白中，需要較高濃度的六磷酸肌醇（InsP6）才能激活半胱氨酸蛋白酶的自切割活性，這說明缺失組合重復寡肽結構會造成TcsL中的半胱氨酸蛋白酶活性失控變得過度活躍（圖2）。

為了進一步分析組合重復寡肽區(qū)域中抑制半胱氨酸蛋白酶活性的序列位點，研究者們構建了一系列毒素的截短和突變體，通過InsP6誘導的體外酶切實驗，發(fā)現(xiàn)不同長度的組合重復寡肽片段對半胱氨酸蛋白酶的活性有著不同程度的影響。更有趣的是，缺失了組合重復寡肽的TcsL在細胞上的毒性甚至高于全長TcsL，說明該結構區(qū)域還影響了毒素的細胞毒性（圖3）。

之后，陶亮團隊與施一公團隊開展合作，利用冷凍電鏡單顆粒三維重構技術解析了在中性條件下和酸性條件下TcsL全長蛋白的三維結構。研究者發(fā)現(xiàn)，在中性條件下，TcsL呈現(xiàn)一種開放式的構象；而在酸性條件下，組合重復寡肽區(qū)域會發(fā)生近180°的旋轉，形成一種關閉式的構象。其中關閉式的構象中，組合重復寡肽區(qū)域與其它結構域之間產生了兩個分子內的互作界面，從而牢牢地“鎖住”了毒素的其它區(qū)域（圖4）。

接下來，研究者們模擬了TcsL釋放到環(huán)境中，之后再接觸宿主的情形。利用小鼠攻毒模型結合病理分析，研究者發(fā)現(xiàn)缺少組合重復寡肽區(qū)域的TcsL在存在InsP6的環(huán)境中暴露僅僅20分鐘即會完全失活，這對于一種外毒素來說是不可接受的缺點。而全長的TcsL在類似環(huán)境下30分鐘也不會有任何活性損失（圖5）。最后，研究者們還將這一規(guī)律在大梭菌毒素家族的其他成員，包括TcdA，TcdB，TcsH和Tcnα中進行了驗證，發(fā)現(xiàn)它們的組合重復寡肽區(qū)域也有著類似的作用。

基于上述發(fā)現(xiàn)，研究者們提出了一種組合重復寡肽區(qū)域調控TcsL及其它大梭菌毒素穩(wěn)定性和毒性的模型（圖6）。作為一類外毒素，TcsL在被細菌釋放到胞外后將面臨各種復雜的環(huán)境條件。毒素可能以開放和關閉兩種構象存在，其中開放式構象的組合重復寡肽區(qū)域舒展，暴露出毒素的核心區(qū)，這種構象對于攻擊宿主細胞更為有利。而在一些相對嚴厲的條件下（如低pH值等），毒素傾向于轉變?yōu)殛P閉式的構象，這種構象分子結構更為緊密和牢固，不易發(fā)生自剪切和降解。這種構象更利于維持毒素的穩(wěn)定性和活性，直至毒素分子接觸到其目標宿主細胞。